Neben originären Universitätsbeständen ist ein Großteil des heutigen Handschriftenbestands als Säkularisationsgut insbesondere aus den Klöstern der Region und aus Gelehrtenbibliotheken bzw. -nachlässen im 19. Jahrhundert in die Universitätsbibliothek gekommen. Unter letzteren sind die des Freiburger Alttestamentlers und Orientalisten Johann Leonhard Hug (1765–1846) und die des Theologen, Philologen und Rastatter Gymnasialprofessors Franz Karl Grieshaber (1798–1866) von besonderer Bedeutung. So kamen über den Nachlass Hug 55 Handschriften, darunter 31 orientalische, aus dem Nachlass Grieshaber 44 meist theologische Handschriften in universitären Besitz.
Bei dem Handschriftenbestand handelt es sich überwiegend um Gebrauchshandschriften: theologische und kanonistische Einzel- und Sammelhandschriften, liturgische Bücher, Predigt- und Legendensammlungen, Bibeln, aber auch um Codices mit römisch-rechtlichen, philosophischen, humanistischen, medizinischen und naturwissenschaftlichen Texten, unter anderem aus frühem universitären Besitz.
Im Sommer 2006 konnte der Bestand durch Ankauf einer privaten Sammlung deutschsprachiger Handschriften des Mittelalters und der Frühen Neuzeit um die Sammlung Leuchte erweitert werden.
Alle abendländischen Handschriften vor 1600 sind schwarz-weiß verfilmt. Die neuzeitlichen Handschriften sind teilweise verfilmt.
Die Bestellung der Handschriften erfolgt nicht über das Ausleihsystem, sondern direkt am Schalter des Sonderlesesaals zu den Schalter-Öffnungszeiten mit Hilfe der genannten Katalogbände (Signatur im Sonderlesesaal: HSS 6 F 465 Bde 1-5)
Handschriften können ausschließlich im Sonderlesesaal zu den Öffnungszeiten unter Vorlage des Bibliotheksausweises bzw. Personalausweises oder eines anderen Dokuments mit gültiger Adresse (bei ausländischen Gästen) eingesehen werden.
Alle bis 1600 geschriebenen Handschriften der UB sind verfilmt (Mikrofilme). Aus konservatorischen Gründen wird für die Benutzung dieser Handschriften in der Regel zuerst der Film angeboten.
